Создание рекомбинантного саффолд-вируса, экспрессирующего UnaG, в качестве маркера для визуализации вирусной инфекции.

Журнал вирусологии, том 20, Номер статьи: 175 (2023) Цитировать эту статью

234 доступа

2 Альтметрика

Подробности о метриках

Вирус Саффолда (SAFV), принадлежащий к роду Cardiovirus семейства Picornaviridae, связан с острыми респираторными или желудочно-кишечными заболеваниями у детей; также предполагается, что он вызывает тяжелые заболевания, такие как острый вялый паралич и асептический менингит. Однако понимание механизма его патогенности по-прежнему ограничено из-за множества неизвестных сведений о его жизненном цикле; например, клеточный рецептор его инфекции еще предстоит определить. Для ускорения исследований по SAFV необходима система мониторинга инфекции SAFV in vitro и in vivo.

Мы создали рекомбинантный SAFV, экспрессирующий зеленый флуоресцентный белок (GFP) или UnaG, новый флуоресцентный белок, полученный из японского угря. Клетки HeLa, инфицированные GFP или UnaG-экспрессирующим SAFV, демонстрировали ярко-зеленый флуоресцентный сигнал, что позволяет удобно отслеживать инфекцию SAFV. Однако экспрессия GFP, но не UnaG, быстро терялась во время пассирования вируса из-за разницы в генетической стабильности генома вируса SAFV; ген UnaG стабильно сохранялся в геноме вируса как минимум после пяти пассажей.

Инфекцию SAFV культивируемых клеток можно легко отслеживать с помощью SAFV, экспрессирующего UnaG, который превосходит GFP с точки зрения генетической стабильности в геноме вируса. Этот вирус может быть полезным инструментом для исследований SAFV, таких как сравнение восприимчивости различных клеток к инфекции SAFV и оценка влияния противовирусных препаратов на инфекцию SAFV при высокопроизводительном скрининге.

Вирус Саффолда (SAFV) принадлежит к роду Cardiovirus семейства Picornaviridae, который представляет собой небольшую, безоболочку, икосаэдрическую частицу с геномом одноцепочечной РНК с положительным смыслом. SAFV был обнаружен как первый кардиовирус человека в 2007 году в кале младенца с лихорадкой неизвестного происхождения в 1981 году [1]. С тех пор сообщалось о выявлении САФВ у детей, страдающих острыми респираторными или желудочно-кишечными заболеваниями [2,3,4,5,6]. Кроме того, SAFV были обнаружены в образцах пациентов с тяжелыми заболеваниями (например, острым вялым параличом, асептическим менингитом, миокардитом, острым панкреатитом и мозжечками) [7,8,9,10,11]. Однако патогенность вируса SAFV, вызывающего разнообразные симптомы от легких до тяжелых, остается неясной. Использование рекомбинантного SAFV, содержащего репортерный ген, такой как зеленый флуоресцентный белок (GFP), который обеспечивает удобный мониторинг репликации SAFV в режиме реального времени in vitro и in vivo, было бы очень полезно для выяснения механизма патогенности SAFV.

Геном SAFV состоит из длинной открытой рамки считывания (ORF), 5'- и 3'-нетранслируемых областей (UTR) и поли(A)-хвоста переменной длины на 3'-UTR. ORF кодирует лидерный белок (L), четыре капсидных белка (от VP1 до VP4) и семь неструктурных белков (2 A, 2B, 2 C, 3 A, 3B, 3 C и 3D) [1]. Полипротеин транслируется из ORF, а затем посттрансляционно процессируется 3C-протеазой в зрелые вирусные белки, тогда как котрансляционное разделение полипротеина происходит по мотиву StopGo. Этот мотив представляет собой олигопептид D(V/I) ExNPG|P (где «|» обозначает соединение между 2 A и 2B), опосредующий процесс StopGo [12, 13], и консервативен в соединении 2 A/2B SAFV. (ДИЕТНПГ|П) [14]. Процесс StopGo также называют «пропуском рибосом» или «Stop-Carry On». Он предотвращает образование пептидной связи между глицином и пролином, но позволяет продолжить трансляцию.

Для продвижения молекулярно-патогенетических исследований SAFV с использованием обратной генетики мы ранее создали инфекционный клон кДНК SAFV-3 (штамм JPN08-404) [8]. В настоящем исследовании на основе этого клона кДНК мы создали два рекомбинантных SAFV, экспрессирующих репортерный ген, GFP или UnaG, чтобы легко обнаружить инфекцию в живых клетках, вставив их между 2A и 2B с использованием мотива StopGo. UnaG — новый зеленый флуоресцентный белок, полученный из японского угря [15], который имеет 139 аминокислот и меньше по размеру по сравнению с GFP (239 аминокислот). В настоящем исследовании мы показываем, что UnaG является лучшим маркером инфекции SAFV по сравнению с GFP с точки зрения геномной стабильности вирусного генома. Кроме того, мы показываем полезность UnaG-экспрессирующего SAFV для изучения инфекции SAFV и скрининга противовирусных препаратов.