Разработка пептидной нуклеиновой кислоты

Научные отчеты, том 13, Номер статьи: 12482 (2023) Цитировать эту статью

531 Доступов

1 Альтметрика

Подробности о метриках

Для обеспечения безопасности пищевых продуктов были широко разработаны многочисленные новые методы обнаружения патогенов пищевого происхождения. Среди важных бактерий пищевого происхождения Bacillus cereus был идентифицирован как вызывающий беспокойство патоген, вызывающий различные пищевые заболевания, что вызвало интерес к разработке эффективных методов обнаружения этого патогена. Хотя доступен стандартный метод, основанный на культивировании и биохимическом подтверждающем тесте, он требует много времени и труда. Альтернативные методы на основе ПЦР были разработаны, но им не хватает высокой производительности и простоты использования. Таким образом, в этом исследовании предпринята попытка разработать надежный метод обнаружения B. cereus путем использования высокоспецифичных пирролидинилпептидных нуклеиновых кислот (ПНК) в качестве зондов для метода массива шариков с мультиплексной и высокопроизводительной способностью. В этом исследовании ПНК, несущие основную цепь пролил-2-аминоциклопентанкарбоновой кислоты (ACPC) с последовательностями рРНК groEL, motB и 16S, были ковалентно связаны с тремя наборами шариков с флуоресцентным штрих-кодом для обнаружения трех генов B. cereus. Разработанная матрица шариков на основе acpcPNA продемонстрировала хорошую селективность: сигналы обнаруживались только в присутствии B. cereus, но не в присутствии других видов. Было обнаружено, что чувствительность этого анализа на шариках на основе acpcPNA при обнаружении геномной ДНК составляет 0,038, 0,183 и 0,179 нг для groEL, motB и 16S рРНК соответственно. Эта производительность явно превосходила его аналог из ДНК, что подтверждает гораздо более сильную силу связывания acpcPNA по сравнению с ДНК. Надежность разработанного метода была дополнительно продемонстрирована путем тестирования молока с искусственными добавками и маринованной зелени горчицы с минимальным влиянием пищевых показателей. Таким образом, было доказано, что этот метод проверки концепции на основе acpcPNA с использованием массивов шариков служит эффективным альтернативным методом на основе нуклеиновых кислот для борьбы с патогенами пищевого происхождения.

Bacillus cereus является одним из основных патогенов пищевого происхождения, который можно обнаружить в широком спектре пищевых продуктов, начиная от готовых к употреблению продуктов, ферментированных продуктов и молочных продуктов1. Из-за своей толерантности к экстремальным значениям pH и температуре B. cereus обычно обнаруживался на различных стадиях обработки пищевых продуктов2, что приводило к серьезным вспышкам пищевого происхождения во всем мире с общей распространенностью до 23,746%. В Европе это вторая причина вспышек заболеваний пищевого происхождения после Staphylococcus aureus3. В США около 63 000 человек в год заболевают, при этом уровень госпитализации составляет 0,4% от группы Bacillus4.

Быстрые и точные методы, позволяющие своевременный мониторинг и обнаружение B. cereus в пищевых продуктах, могут служить ключевым методом смягчения последствий вспышек заболевания. Более того, учитывая, что не все виды Bacillus являются патогенными, крайне важно иметь возможность идентифицировать их на уровне видов Bacillus5. Хотя доступен стандартный метод ISO 7932:2004, основанный на протоколе подсчета на агаровой чашке6, этот метод требует много времени и труда (требуется инкубационный период до 24 часов при 30 °C с дополнительными 2–7 днями для подтверждения). анализ) и требует обученных специалистов. Для идентификации B. cereus были разработаны альтернативные молекулярные методы, такие как полимеразная цепная реакция (ПЦР)7,8. Однако большинство этих методов, основанных на ПЦР, основаны на методах гель-электрофореза с низким разрешением для визуализации продуктов ПЦР, что затрудняет их интерпретацию результатов. Поэтому многие передовые методы на основе ПЦР, такие как количественная ПЦР (кПЦР) и мультиплексная ПЦР, были разработаны для преодоления этих ограничений9,10,11, но их мультиплексная способность все еще ограничена из-за осложнений, связанных с образованием димеров праймеров12. Кроме того, большинство методов, основанных на ПЦР, зависят от ДНК как специфического зонда, который может разрушаться под воздействием факторов окружающей среды, таких как температура, pH и ферменты.

Чтобы преодолеть эти ограничения, в этом исследовании продемонстрирован метод обнаружения B. cereus, сочетающий преимущества мультиплексной способности и простоты получения результатов с помощью метода массива шариков, а также высокоспецифичной пептидной нуклеиновой кислоты (ПНК) в качестве альтернативного зонда. Платформа массива шариков, использованная в этом исследовании, основана на высокопроизводительной, чувствительной и мультиплексной технологии xMAP для различных типов целей13,14. В этом методе используются парамагнитные шарики с флуоресцентным штрих-кодом, функционализированные карбоксильными группами для ковалентного присоединения нуклеофильных лигандов. Каждый набор шариков может быть идентифицирован красным лазером, а сигнал от флуоресцентного репортера (R-фикоэритрина) измеряется зеленым лазером13,15,16. По сравнению с традиционными методами ДНК-микрочипов технология шариковых матриц обеспечивает ряд преимуществ. Во-первых, производительность этой техники явно выше. Это связано с тем, что она считается полуавтоматической, а технология ДНК-микрочипов — нет. Во-вторых, благодаря этапу автоматической промывки технология с использованием шариковых матриц обычно демонстрирует более низкий фон и более высокую консистенцию, чем технология с использованием ДНК-микрочипов17. Наконец, стоимость детектора в технологии массива шариков намного дешевле, чем у ДНК-микрочипа, что делает его более практичным. Таким образом, различные системы на основе ДНК успешно применяются для обнаружения широкого спектра пищевых загрязнений, таких как пищевые аллергены18, патогены пищевого происхождения в курином мясе19 и четыре патогена пищевого происхождения, включая Salmonella Typhimurium, Brucella spp., B. cereus и Shigella. виды в молочных продуктах20. Интересно, что описанный метод обнаружения B. cereus требовал повышенной температуры при 38 ° C для получения обнаруживаемого сигнала, вероятно, из-за меньшей стабильности связывания ДНК-ДНК по сравнению со связыванием ПНА-ДНК. Это делает его непрактичным для реальной промышленной переработки20. Более того, во всех описанных методах массива шариков использовалась ДНК в качестве специфического зонда, специфичность которого существенно зависит от температуры гибридизации и длины зондов21. Мы предположили, что использование альтернативных имитаторов нуклеиновых кислот с большей аффинностью связывания с ДНК-мишенью может улучшить общие характеристики восприятия.