Диффузные сигнальные факторы (DSF) связывают и подавляют VirF, ведущий активатор вирулентности Shigella flexneri.

Научные отчеты, том 13, Номер статьи: 13170 (2023) Цитировать эту статью

262 доступа

1 Альтметрика

Подробности о метриках

Шигелла, этиологический агент бактериальной дизентерии человека, контролирует экспрессию своих детерминант вирулентности посредством стимулируемого окружающей средой каскада активаторов транскрипции. VirF является ведущим активатором и необходим для правильного выражения вирулентности. В этой работе мы сообщаем об экспериментах in vitro и in vivo, показывающих, что два аутоиндуктора семейства DSF, XcDSF и BDSF, взаимодействуют с модулем желейного рулона VirF, вызывая его ингибирование и влияя на экспрессию всей системы вирулентности шигелл, включая ее способность инвазировать эпителиальные клетки. Мы предлагаем молекулярную модель, объясняющую, как связывание XcDSF и BDSF вызывает ингибирование VirF, предотвращая его димеризацию. В целом, наши экспериментальные результаты показывают, что XcDSF и BDSF могут способствовать «колонизационной устойчивости» в кишечнике человека или, альтернативно, могут использоваться для точной настройки экспрессии вирулентности шигелл, когда бактерия мигрирует из просвета кишечника, чтобы приблизиться к слизистой оболочке кишечника. Наши результаты также подчеркивают, как детальное понимание взаимодействия лигандов DSF с VirF может способствовать рациональной разработке инновационных противовирусных препаратов для лечения шигеллеза.

Шигеллы — это энтеропатогенная грамотрицательная бактерия, вызывающая шигеллез, заболевание, которым ежегодно страдают около 125 миллионов человек во всем мире, с летальным исходом примерно в 164 000 случаев1,2. Чтобы заразить слизистую оболочку кишечника человека, шигелла использует специфическую систему секреции типа III (T3SS), чтобы способствовать бактериальной инвазии путем инъекции ряда факторов в цитоплазму клетки-хозяина3. Гены, кодирующие белковый компонент этого ССТТ, факторы, участвующие в его сборке, и инъецируемые эффекторы сгруппированы в области, подобной большому острову патогенности (PAI), внутри плазмиды вирулентности шигелл (pINV)4. Экспрессия генов T3SS контролируется регуляторным каскадом, запускаемым регулятором транскрипции AraC-XylS VirF, который находится на вершине каскада5,6. Белок VirF способствует транскрипции двух генов, критически важных для вирулентности шигелл: icsA и virB. Белок IcsA участвует во внутриклеточной подвижности бактерий7,8, а белок VirB, действуя как второй положительный регулятор системы вирулентности, отвечает за экспрессию основных уровней регуляторного каскада шигелл9,10. Примечательно, что гены virF, virB и icsA представляют собой гены плазмиды pINV, расположенные вне PAI-подобной области. VirF регулируется на уровне транскрипции несколькими стимулами окружающей среды, такими как температура, pH и осмолярность, а на посттранскрипционном уровне с помощью MiaA10. Совсем недавно мы показали, что активность VirF также напрямую контролируется жирными кислотами (ЖК)11. В частности, жирные кислоты, такие как лауриновая, каприновая, миристолеиновая, пальмитолеиновая и сапиеновая кислоты, связывают VirF и инактивируют его активность, способствующую транскрипции, вероятно, вызывая изменение структуры белка из свободного, функционального («открытого») состояния в связанное с ЖК. , нефункциональная («закрытая») форма. Подобный механизм с участием ЖК был предложен ранее для других регуляторов вирулентности, таких как ToxT V. cholerae, Rns энтеротоксигенной E. coli (ETEC) и HilD Salmonella enterica12,13,14. Недавно цис-2-гексадеценовая кислота была включена в число лигандов, которые связывают и ингибируют HilD, тем самым влияя на экспрессию гена вирулентности S. enterica14,15. Это соединение принадлежит к редкому классу ЖК, синтезируемых грамотрицательными бактериями, называемому «Диффузионные сигнальные факторы» (ДСФ). К DSF относятся ЖК с различной длиной цепи и характером ветвления с ненасыщенной цис-связью в положении 2, за исключением 13-метилтетрадекановой кислоты (LeDSF). Кроме того, было показано, что DSF служат сигнальными молекулами в системах бактериального кворума (QS)16,17 и регулируют различные функции широкого спектра бактерий, включая патогены растений и животных17,18. Прототипом молекулы DSF является цис-11-метил-2-додеценовая кислота (XcDSF), продуцируемая фитопатогенной бактерией Xanthomonas Campestris17,19. Другие основные, ранее охарактеризованные члены семейства DSF включают цис-2-деценовую кислоту (PDSF); цис-2-додеценовая кислота (BDSF); цис,цис-11-метилдодека-2,5-диеновая кислота (CDSF); цис-10-метил-2-додеценовая кислота (IDSF); цис-2-тетрадеценовая кислота (XfDSF1); и цис-2-гексадеценовая кислота (XfDSF2). Бактерии, синтезирующие DSF, являются частью постоянно обновляемого списка и характеризуются наличием гена rpfF (или его гомолога), имеющего решающее значение для синтеза DSF17,20. На сегодняшний день в список продуцентов ДФС входят Xanthomonas spp., Xylella fastidiosa, Pseudomonas aeruginosa, Stenotropomonasmaltophilia, Lysobacter enzymogenes и brunescens, Leptospirillum Ferroxidans, Burkholderia cenocepacia и Cronobacter turicensis17. Бактерии, принадлежащие к родам Frateuria, Luteobacter, Pseudoxhantomonas и Rhodanobacter, также могут быть включены на основании предсказания in silico17. Локус генов, ответственный как за продукцию DSF, так и за их распознавание в качестве сигнала, определяющего кворум, был впервые охарактеризован у X. Campestris и включает четыре гена: rpfC, rpfG, rpfB и rpfF18,21,22. RpfC и RpfG образуют двухкомпонентную систему, а RpfB представляет собой лигазу для длинноцепочечных молекул ацил-КоА. RpfF представляет собой фермент суперсемейства кротоназ (активность еноил-КоА-дегидратазы и тиоэстеразы) и действует на белок-переносчик ацилов (ацил-АСР), промежуточный продукт синтеза жирных кислот, с целью синтеза XcDSF. Когда бактериальная популяция достигает критической плотности, XcDSF взаимодействует с сенсором RpfC, вызывая фосфорилирование белка-регулятора ответа RpfG. Благодаря своей гидролитической активности фосфорилированный RpfG превращает второй мессенджер бис-(3'-5')-циклический GMP (c-ди-GMP) в GMP. Снижение внутриклеточного уровня c-di-GMP приводит к нарушению регуляции генов-мишеней18. У Burkholderia cenocepacia биосинтез молекул DSF (BDSF) полностью зависит от RpfFBc, бифункционального фермента с еноил-КоА-гидратазной и тиоэстеразной активностью. Этот фермент демонстрирует значительную идентичность последовательности с белком RpfF X. Campestris. Несмотря на большое сходство XcDSF и BDSF в пути биосинтеза и химической структуре, механизм, с помощью которого B. cenocepacia воспринимает BDSF, отличается от механизма, характерного для X. Campestris, поскольку он включает цитоплазматический рецептор, белок RpfR. Этот фермент проявляет активность циклической ди-ГМФ-фосфодиэстеразы после связывания с BDSF, что приводит к снижению цитоплазматического c-ди-АМФ23. Интересно, что этот механизм распознавания и регуляции очень похож на взаимодействие между HilD и цис-2-гексадеценовой кислотой, которое вызывает подавление вирулентности S. enterica. Учитывая высокое структурное сходство между XcDSF, BDSF и лауриновой кислотой (рис. S1), ранее охарактеризованным ингибитором активности VirF11, мы спросили, могут ли XcDSF и BDSF ингибировать вирулентность шигелл, предотвращая активацию белка VirF, способствующую транскрипции. В настоящем исследовании с помощью экспериментов in silico, in vitro и in vivo мы показываем, что XcDSF и BDSF напрямую взаимодействуют с VirF, что приводит к значительному снижению транскрипции virB, тем самым препятствуя экспрессии всей системы вирулентности шигелл и вызывая дефектный фенотип, характеризующийся недостаточной инвазией клеток-хозяев и замедленной пролиферацией внутри них.